血清免疫学检查（补充件）
B1 间接荧光抗体试验（IFAT）
B1.1 抗原片
B1.1.1 马来丝虫成虫冰冻切片抗原：用马来丝虫感染期幼虫腹腔感染长爪沙鼠。6个月后，从感染鼠腹腔收集雌性成虫。用生理盐水洗涤2次，蒸馏水漂洗1次，包埋于3％～5％甲基纤维素中，用冷冻切片机制成厚4～5μm的切片（每一切片含4～6个虫体横断面），贴附于洁净的载玻片上，用丙酮固定，干燥保存于-20℃备用。
B1.1.2 马来微丝蚴断片抗原：从感染马来丝虫的长爪沙鼠腹腔液中收集马来微丝蚴，用PBS（或生理盐水）洗净。其悬液置冰格过夜，次日离心浓集，以甲醇固定，然后进行反复超声断碎，超声粉碎机输出功率不小于25W（每次30s，间隔30～60s，共3～5min），至微丝蚴断片为长20～30μm.滴1滴微丝蚴断片悬液（≥100断片/滴）在洁净的载玻片上，经50℃左右热烘固定3min后使用。
B1.2 血样：血清或滤纸血。
B1.2.1 血清：采集受检者的静脉血或末梢血，离心后收集血清。在低温下运送，4℃保存，-20℃可保存2年左右。其间不宜反复冻融，以免影响抗体效价。
B1.2.2 滤纸干血滴：用定量新华滤纸从受检者的耳垂或指尖取血，使血滴直径为1.2cm，血量约20μL（约相当血清10μL），编号、晾干后放入有干燥剂的塑料袋内低温保存。4℃可保存半年，-20℃可保存2年。
B1.3 操作方法：受检血清用pH8.0、0.01mol/L PBS稀释成1∶10或1∶20（每一滤纸干血滴在0.1或0.2mL的PBS液中浸泡30min）。从冰箱取出抗原片，待复温后，在每一切片或一滴抗原上加1滴稀释待检血清，置37℃湿育30min.用PBS洗3次（每次5min）后冷风吹干，滴加用PBS稀释的羊抗人IgG荧光抗体，同上湿育，洗涤，以0.01％伊文思蓝作背景染色2min，同上洗涤，吹干。再加缓冲甘油（pH8.0）后覆以盖玻片在荧光显微镜下检查。对阳性反应的血样需连续作倍比稀释检测，直至阴性反应为止。最后呈阳性反应的稀释度即为阳性终点滴度。
B1.4 反应标准
B1.4.1 马来丝虫成虫切片抗原，以虫体切面的荧光强度及荧光着色范围区分为4个等级：“－”虫体切面呈桔红色，无明显的黄绿色荧光；“＋”一般亮度的黄绿色荧光，显色范围较局限；“＋＋”中等亮度的黄绿色荧光，显色较广泛；“＋＋＋”明亮的黄绿色荧光，显色广泛。一般以1：20血样滴度时荧光反应强度呈“＋”及其以上者，判为阳性。
B1.4.2 微丝蚴断片抗原，以微丝蚴断片的荧光强度及着色范围区分成4个等级：“－”微丝蚴断端呈模糊的淡黄绿色或红色：“＋”断端呈黄绿色荧光，形似哑铃，反衬红色明显；“＋＋”断端黄绿色荧光显著，膜上也有黄绿色荧光；“＋＋＋”断端和膜均呈明亮的黄绿色荧光。一般以1：10血样滴度时出现“＋”及其以上的荧光反应，判为阳性。
B2 酶联免疫吸附试验（ELISA）
B2.1 抗原：马来丝虫成虫可溶性抗原，从感染马来丝虫长爪沙鼠的腹腔收集马来丝虫成虫。虫体经生理盐水洗涤和蒸馏水漂洗后，置丙酮脱脂干燥，然后加0.01％硫柳汞生理盐水研磨成匀浆，冻融3天（每天2次）后置4℃冷浸3～4天，超声粉碎后低温高速（7000r/min）离心30min，上清液即可溶性抗原。用分光光度仪测定235和280nm波长处的光密度值（OD），按式（B1）计算抗原蛋白量：X（mg/mL）＝（OD235－OD280）×0.4…（B1）
B2.2 操作方法
B2.2.1 常规间接ELISA：用pH9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液将抗原按适宜的工作浓度（2～5μg/孔）稀释，包被聚苯乙烯反应板，每孔加0.3mL，4℃过夜。次日倾去抗原液，用pH7.2 PBS/吐温-20（PBS/T）洗涤3次，每次5min，甩干。受检血清（或滤纸干血滴）用PB3/T稀释成1∶200，每孔加0.3mL，每样本加3孔，置湿盒于37℃湿育2h，同上洗涤，甩干。每孔加入0.3mL PBS/T的辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG，同上湿育，洗涤，甩干。然后加底物溶液［邻苯二胺40mg，柠檬酸－磷酸盐缓冲液50mL，蒸馏水50mL和30％过氧化氢（H2O2）40μL〕0.3mL同上湿育，最后每孔加2mol/L硫酸（H2SO4）75μL终止反应。将每样品3孔的液量吸至比色杯（杯径1cm），在分光光度仪上测量492nm波长处的光密度（OD）值。每板均设阳性参考血清、阴性参考血清和空白对照孔。测得样品OD值进行校正。
B2.2.2 改良的间接ELISA：按适宜工作浓度用pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释抗原，包被40孔聚苯乙烯反应板，每孔加0.1mL，4℃过夜。次日倾去抗原液，用pH7.2 PBS/T洗涤3次，每次5min，甩干。受检血样用PBS/T稀释成1∶200，每孔加0.1mL，每样本加2孔，置湿盒，37℃湿育30min，同上洗涤，甩干。每孔加0.1mL PBS/T稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG，同上湿育，洗涤，甩干。然后加底物溶液0.1mL，同上湿育后加2mol/L硫酸（H2SO4）25μL终止反应。用专用酶标检测仪（以PBS对照孔校正零点后）测定492（或490）nm波长的各孔OD值。每板设阳性参考血清，阴性参考血清和PBS对照。每样品的OD值以2孔的平均OD值计，再以同板的阳性参考血清OD值作校正。
B2.3 反应标准
测定100份以上健康人的血清，求其OD值和标准差（SD），以OD均值加2SD作为阳性反应阈值（通常为0.4）。当样品OD值等于或大于该值时即判为阳性。或以样品OD值（P）和阴性参考血清OD值（N）的比值P/N≥2者为阳性。
B3 溶液的配制
B3.1 pH8.0，0.01mol/L PBS液原液0.2mol/L磷酸盐缓冲液
a. NaH2PO4·2H2O 15.6g 蒸馏水加至 500mL
b. Na2HPO4·12H2O 35.82g 蒸馏水加至 500mL
取a液5.3mL，b液94.7mL，NaCl 17g加水至2000mL
B3.2 pH8.0缓冲甘油5份甘油（一级）和1份0.01mol/L PBS（pH8.0）混匀后冰箱保存（无气泡）。
B3.3 pH9.6、0.05mol/L碳酸盐缓冲液
Na2CO3 15.9g
NaHCO3 2.93g
蒸馏水加至 1000mL
B3.4 pH7.2 PBS/吐温－20
NaCl 8.0g
KH2PO4 0.2g
Na2HPO4·12H2O 2.9g
KCl 0.2g
吐温－20 0.5mL
临用前加蒸馏水至 1000mL
B3.5 pH5.0磷酸盐－柠檬酸缓冲液底物溶液
0.1mol/L 柠檬酸溶液（21.041g/L） 25.7mL
0.2mol/L Na2HPO4（28.4g/L） 24.3mL
蒸馏水 50mL
邻苯二胺 40mg
临用前加30％过氧化氢（H2O2） 40μL|整理
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B1 间接荧光抗体试验（IFAT）
B1.1 抗原片
B1.1.1 马来丝虫成虫冰冻切片抗原：用马来丝虫感染期幼虫腹腔感染长爪沙鼠。6个月后，从感染鼠腹腔收集雌性成虫。用生理盐水洗涤2次，蒸馏水漂洗1次，包埋于3％～5％甲基纤维素中，用冷冻切片机制成厚4～5μm的切片（每一切片含4～6个虫体横断面），贴附于洁净的载玻片上，用丙酮固定，干燥保存于-20℃备用。
B1.1.2 马来微丝蚴断片抗原：从感染马来丝虫的长爪沙鼠腹腔液中收集马来微丝蚴，用PBS（或生理盐水）洗净。其悬液置冰格过夜，次日离心浓集，以甲醇固定，然后进行反复超声断碎，超声粉碎机输出功率不小于25W（每次30s，间隔30～60s，共3～5min），至微丝蚴断片为长20～30μm.滴1滴微丝蚴断片悬液（≥100断片/滴）在洁净的载玻片上，经50℃左右热烘固定3min后使用。
B1.2 血样：血清或滤纸血。
B1.2.1 血清：采集受检者的静脉血或末梢血，离心后收集血清。在低温下运送，4℃保存，-20℃可保存2年左右。其间不宜反复冻融，以免影响抗体效价。
B1.2.2 滤纸干血滴：用定量新华滤纸从受检者的耳垂或指尖取血，使血滴直径为1.2cm，血量约20μL（约相当血清10μL），编号、晾干后放入有干燥剂的塑料袋内低温保存。4℃可保存半年，-20℃可保存2年。
B1.3 操作方法：受检血清用pH8.0、0.01mol/L PBS稀释成1∶10或1∶20（每一滤纸干血滴在0.1或0.2mL的PBS液中浸泡30min）。从冰箱取出抗原片，待复温后，在每一切片或一滴抗原上加1滴稀释待检血清，置37℃湿育30min.用PBS洗3次（每次5min）后冷风吹干，滴加用PBS稀释的羊抗人IgG荧光抗体，同上湿育，洗涤，以0.01％伊文思蓝作背景染色2min，同上洗涤，吹干。再加缓冲甘油（pH8.0）后覆以盖玻片在荧光显微镜下检查。对阳性反应的血样需连续作倍比稀释检测，直至阴性反应为止。最后呈阳性反应的稀释度即为阳性终点滴度。
B1.4 反应标准
B1.4.1 马来丝虫成虫切片抗原，以虫体切面的荧光强度及荧光着色范围区分为4个等级：“－”虫体切面呈桔红色，无明显的黄绿色荧光；“＋”一般亮度的黄绿色荧光，显色范围较局限；“＋＋”中等亮度的黄绿色荧光，显色较广泛；“＋＋＋”明亮的黄绿色荧光，显色广泛。一般以1：20血样滴度时荧光反应强度呈“＋”及其以上者，判为阳性。
B1.4.2 微丝蚴断片抗原，以微丝蚴断片的荧光强度及着色范围区分成4个等级：“－”微丝蚴断端呈模糊的淡黄绿色或红色：“＋”断端呈黄绿色荧光，形似哑铃，反衬红色明显；“＋＋”断端黄绿色荧光显著，膜上也有黄绿色荧光；“＋＋＋”断端和膜均呈明亮的黄绿色荧光。一般以1：10血样滴度时出现“＋”及其以上的荧光反应，判为阳性。
B2 酶联免疫吸附试验（ELISA）
B2.1 抗原：马来丝虫成虫可溶性抗原，从感染马来丝虫长爪沙鼠的腹腔收集马来丝虫成虫。虫体经生理盐水洗涤和蒸馏水漂洗后，置丙酮脱脂干燥，然后加0.01％硫柳汞生理盐水研磨成匀浆，冻融3天（每天2次）后置4℃冷浸3～4天，超声粉碎后低温高速（7000r/min）离心30min，上清液即可溶性抗原。用分光光度仪测定235和280nm波长处的光密度值（OD），按式（B1）计算抗原蛋白量：X（mg/mL）＝（OD235－OD280）×0.4…（B1）
B2.2 操作方法
B2.2.1 常规间接ELISA：用pH9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液将抗原按适宜的工作浓度（2～5μg/孔）稀释，包被聚苯乙烯反应板，每孔加0.3mL，4℃过夜。次日倾去抗原液，用pH7.2 PBS/吐温-20（PBS/T）洗涤3次，每次5min，甩干。受检血清（或滤纸干血滴）用PB3/T稀释成1∶200，每孔加0.3mL，每样本加3孔，置湿盒于37℃湿育2h，同上洗涤，甩干。每孔加入0.3mL PBS/T的辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG，同上湿育，洗涤，甩干。然后加底物溶液［邻苯二胺40mg，柠檬酸－磷酸盐缓冲液50mL，蒸馏水50mL和30％过氧化氢（H2O2）40μL〕0.3mL同上湿育，最后每孔加2mol/L硫酸（H2SO4）75μL终止反应。将每样品3孔的液量吸至比色杯（杯径1cm），在分光光度仪上测量492nm波长处的光密度（OD）值。每板均设阳性参考血清、阴性参考血清和空白对照孔。测得样品OD值进行校正。
B2.2.2 改良的间接ELISA：按适宜工作浓度用pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释抗原，包被40孔聚苯乙烯反应板，每孔加0.1mL，4℃过夜。次日倾去抗原液，用pH7.2 PBS/T洗涤3次，每次5min，甩干。受检血样用PBS/T稀释成1∶200，每孔加0.1mL，每样本加2孔，置湿盒，37℃湿育30min，同上洗涤，甩干。每孔加0.1mL PBS/T稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG，同上湿育，洗涤，甩干。然后加底物溶液0.1mL，同上湿育后加2mol/L硫酸（H2SO4）25μL终止反应。用专用酶标检测仪（以PBS对照孔校正零点后）测定492（或490）nm波长的各孔OD值。每板设阳性参考血清，阴性参考血清和PBS对照。每样品的OD值以2孔的平均OD值计，再以同板的阳性参考血清OD值作校正。
B2.3 反应标准
测定100份以上健康人的血清，求其OD值和标准差（SD），以OD均值加2SD作为阳性反应阈值（通常为0.4）。当样品OD值等于或大于该值时即判为阳性。或以样品OD值（P）和阴性参考血清OD值（N）的比值P/N≥2者为阳性。
B3 溶液的配制
B3.1 pH8.0，0.01mol/L PBS液原液0.2mol/L磷酸盐缓冲液
a. NaH2PO4·2H2O 15.6g 蒸馏水加至 500mL
b. Na2HPO4·12H2O 35.82g 蒸馏水加至 500mL
取a液5.3mL，b液94.7mL，NaCl 17g加水至2000mL
B3.2 pH8.0缓冲甘油5份甘油（一级）和1份0.01mol/L PBS（pH8.0）混匀后冰箱保存（无气泡）。
B3.3 pH9.6、0.05mol/L碳酸盐缓冲液
Na2CO3 15.9g
NaHCO3 2.93g
蒸馏水加至 1000mL
B3.4 pH7.2 PBS/吐温－20
NaCl 8.0g
KH2PO4 0.2g
Na2HPO4·12H2O 2.9g
KCl 0.2g
吐温－20 0.5mL
临用前加蒸馏水至 1000mL
B3.5 pH5.0磷酸盐－柠檬酸缓冲液底物溶液
0.1mol/L 柠檬酸溶液（21.041g/L） 25.7mL
0.2mol/L Na2HPO4（28.4g/L） 24.3mL
蒸馏水 50mL
邻苯二胺 40mg
临用前加30％过氧化氢（H2O2） 40μL|整理
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